一、基因敲减
基因敲减(knock-down,KD)通常也称基因沉默(Silence),是指通过降解具有同源序列靶基因的mRNA,达到阻止基因表达的作用,常用技术有siRNA,shRNA等。
二、shRNA基因敲减原理
shRNA(short hairpin RNA),即短发夹RNA,包括两个短反向重复序列,中间由一茎环(loop)序列分隔组成发夹结构,该元件由RNA聚合酶Ⅲ(PolⅢ)启动子控制。随后再连上5~6个“T”作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。该发夹序列在细胞内形成一个“双链RNA”(dsRNA),被胞内核酸内切酶(Dicer)识别并切割成小片段,这些片段在mRNA解旋酶的作用下解链。其中反义链与内切酶、外切酶、解旋酶等结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-InducedSilencingComplex,RISC),RISC与靶基因mRNA的同源区特异性结合,对靶基因mRNA进行切割,从而阻断目的基因表达。慢病毒介导的基因沉默原理如Fig.1所示。
三、shRNA慢病毒优势
1. 慢病毒转导效率高,可转导细胞种类多;
2. 慢病毒载体所携带的敲减元件可以整合插入细胞基因组,实现目的基因长期稳定敲减;
3. 利用慢病毒敲减技术构建的稳转细胞株更适合做体内实验;
4. 慢病毒敲减技术成熟,安全性好,认可度高;
四、维根生物shRNA慢病毒载体种类丰富
启动子类型 |
嘌呤霉素抗性 |
杀稻瘟菌素 |
U6 |
pLenti-Puro+U6-MCS |
pLenti-BSD+U6-MCS |
pLenti-GFP-Puro+U6-MCS |
pLenti-GFP- BSD +U6-MCS |
pLenti-RFP-Puro+U6-MCS |
pLenti-RFP-BSD +U6-MCS |
H1 |
pLenti-Puro+H1-MCS |
pLenti-BSD +H1-MCS |
pLenti-GFP-Puro+ H1-MCS |
pLenti-GFP-BSD + H1-MCS |
pLenti-RFP-Puro+ H1-MCS |
pLenti-RFP-BSD + H1-MCS |